Meskipun Jepara berhasil dipukul mundur oleh Portugis, namun Ratu Kalinyamat tidak pernah jera. Pada tahun 1565, ia memenuhi permintaan orang-orang Hitu di Ambon untuk menghadapi gangguan bangsa Portugis dan kaum Hative.
Selanjutnya pada tahun 1573 Sultan Aceh meminta bantuan Ratu Kalinyamat untuk menyerang Malaka kembali. Ratu Kalinyamat mengirimkan 300 kapal dengan membawa 15.000 prajurit Jepara. Pasukan yang dipimpin oleh Ki Demang Laksamana tersebut baru tiba di Malaka pada bulan Oktober 1574. Padahal saat itu pasukan Aceh sudah dipukul mundur oleh Portugis.
Pasukan Jepara yang datang terlambat langsung menembaki pasukan Portugis dari Selat Malaka. Besoknya pasukan Jepara mendarat dan membangun pertahanan. Tetapi akhirnya pertahanan pasukan Jepara tersebut dapat ditembus oleh pasukan Portugis.
Bahkan sebanyak 30 kapal Jepara terbakar, pihak Jepara pun mulai terdesak. Namun tetap menolak perundingan damai karena terlalu menguntungkan Portugis. Sementara itu sebanyak enam kapal perbekalan yang dikirim oleh Ratu Kalinyamat direbut Portugis.
Pihak Jepara semakin lemah dan memutuskan pulang. Dari jumlah awal yang dikirimkan oleh Ratu Kalinyamat, hanya sekitar sepertiga saja pasukannya yang kembali tiba dengan selamat di Pulau Jawa.
Meskipun dua kali mengalami kegagalan menyerang Portugis, namun Ratu Kalinyamat telah menunjukkan bahwa dirinya seorang perempuan yang gagah berani. Bahkan Portugis mencatatnya sebagai rainha de Jepara, senhora poderosa e rica, de kranige Dame, yang artinya Rstu Jepara seorang wanita kaya dan berkuasa, seorang perempuan pemberani.